Chloroquine 154

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Protection vasculaire par chloroquine pendant le traitement des tumeurs cérébrales avec Tf-CRM107 Naoshi Hagihara. Stuart Walbridge. Alan W. Olson. Edward H. Oldfield. et de l'Institut Richard J. Youle 1 Biochimie et Sections cliniques, Direction Neurologie chirurgicale, l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies NHSWEHORJY et in Vivo Research Center RMN national des troubles neurologiques et des maladies AWO, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892 Résumé tf-CRM107 est un conjugué de transferrine et d'un mutant ponctuel de la toxine diphtérique qui tue sélectivement les cellules exprimant des niveaux élevés du récepteur de transferrine. Tf-CRM107 a été perfusé par voie intratumorale à des patients atteints de tumeurs cérébrales malignes. Bien que près de la moitié des patients présentent des réponses tumorales, les patients recevant des doses plus élevées de Tf-CRM107 peuvent développer l'image par résonance magnétique (IRM) preuve de toxicité indicative de la petite thrombose des vaisseaux ou d'une hémorragie pétéchiale. Conformément à ces résultats cliniques, nous avons trouvé que l'injection intracérébrale de Tf-CRM107 à des rats à des doses totales 0,025 g provoque des lésions cérébrales détectables par l'IRM et l'histologie. Pour élargir la fenêtre thérapeutique de Tf-CRM107, nous avons exploré les moyens de prévenir ce dommage à la vasculature. Nous avons pensé que le système vasculaire peut être protégé dans une plus grande mesure que la tumeur à partir Tf CRM107 perfusé dans le parenchyme cérébral par i. v. l'injection de réactifs à faible barrière hémato-encéphalique perméabilité qui bloquent la toxicité du Tf-CRM107. La chloroquine, un médicament antipaludéen bien caractérisée, bloque la toxicité de la toxine diphtérique CRM107 et Tf. L'administration systémique de la chloroquine a bloqué la toxicité Tf CRM107 perfusé par voie intracérébrale chez les rats et a changé la dose maximale tolérée de Tf CRM107 de 0,2 à 0,3 g. En outre, le traitement à la chloroquine a complètement bloqué les lésions cérébrales détectées par IRM causée par perfusion intracérébrale de 0,05 g de Tf-CRM107. Chez les souris nues portant s. c. gliomes U251, le traitement à la chloroquine ont eu peu d'effet sur l'efficacité antitumorale de Tf-CRM107. Ainsi, le traitement à la chloroquine peut être utile pour réduire la toxicité de Tf CRM107 pour le cerveau normal sans inhiber l'efficacité antitumorale et d'augmenter la marge thérapeutique de l'EP-CRM107 pour le traitement des tumeurs cérébrales. Introduction Le pronostic des patients atteints de tumeurs cérébrales malignes est médiocre malgré un traitement standard (chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie). Tf-CRM107 (1). un conjugué de TF2 et DT mutant sans fonction de liaison au récepteur (2). peuvent cibler et tuer les cellules exprimant Tf-R, telles que des cellules tumorales. Le potentiel de la Tf CRM107 pour la thérapie des tumeurs cérébrales a été étudiée in vitro (1). dans des modèles animaux (3). et chez les patients atteints de gliomes malins (4). Lors de la livraison par haut débit (410 l / min) microperfusion interstitielle CED (5). perfusion intratumorale de Tf-CRM107 chez les patients atteints de tumeurs cérébrales malignes produit des réponses tumorales (4). Lorsque DEC est utilisé, Tf CRM107 (140 kDa) est répartie de manière préférentielle dans l'espace interstitiel de la tumeur et le cerveau entourant infiltrés par la tumeur et contourne la BHE. Cependant, dans le cerveau, les cellules endotheliales capillaires expriment des niveaux faibles de Tf-R (6). et à des doses élevées Tf-CRM107 peut provoquer des déficits neurologiques compatibles avec des lésions endothéliales. Chez ces patients, l'IRM a révélé des changements dans le cerveau compatible avec l'occlusion microvasculaire et / ou pétéchie (4). Notre objectif était de protéger sélectivement les capillaires du SNC de la toxicité Tf-CRM107 sans protéger les cellules tumorales du cerveau. Nous avons cherché un médicament à faible perméabilité BBB qui pourrait être livré i. v. pour protéger le système vasculaire. amines lysosomotrophique, tels que la chloroquine, sont utilisés en clinique pour traiter le paludisme et certaines maladies du collagène. Ces médicaments accumulent dans les lysosomes et augmentation et neutralisent le pH vésiculaire (7). DT pénètre dans la cellule pour inhiber la synthèse des protéines, en utilisant le faible pH des endosomes et des lysosomes pour déclencher le transport dans le cytosol (8. 9. 10. 11). Ainsi, les blocs de la chloroquine sur la cytotoxicité de la DT (12) et susceptible Tf CRM107. Nous avons étudié le potentiel de la chloroquine pour améliorer l'utilité des immunotoxines pour le traitement d'une tumeur cérébrale en supprimant sélectivement la toxicité pour le système vasculaire sans altérer l'efficacité antitumorale. Matériaux et méthodes Lignes cellulaires et animaux. La lignée cellulaire de glioblastome humain U251MG et 9L lignée cellulaire gliosarcome de rat ont été achetés auprès de American Type Culture Collection. Les deux lignées cellulaires ont été cultivées dans du milieu DMEM additionné de 10 FCS et maintenus à 37 ° C dans un environnement 2 5 de CO. Les expérimentations animales ont été réalisées avec des hommes rats Fisher 344 (Taconic), 2025 semaines d'âge, avec un poids corporel allant de 250 à 300 g et NIH souris nu / nu femelle 46 semaines d'âge, qui ont été pris en charge conformément aux directives du NIH. DT, CRM107 Tf et la chloroquine. DT a été acheté de la liste Biologicals (Campbell, CA). Préparation du mutant CRM107 DT et de sa conjugaison à Tf humaine ont été réalisées comme décrit précédemment (1). étaient liés La toxine et Tf par une liaison thioéther. sel diphosphate de chloroquine (515,9 Da) a été acheté auprès de Sigma (St. Louis, MO). Les toxines et la chloroquine ont été dissous dans du PBS pour les expériences in vitro et dans le sérum physiologique à 0,9 pour les expériences in vivo. Tf-R Expression. L'anticorps monoclonal de souris anti-FT-R a été acheté auprès de Zymed Laboratories (San Francisco, CA). Cet anticorps (H68.4) est spécifique aux résidus 328 de la queue Tf-R N-terminal humain et réagit de manière croisée avec le rat Tf-R. Le cerveau normal, le cervelet, la protubérance annulaire, le bulbe et le segment cervical de la moelle épinière de rats ont été retirés, et les tumeurs ont été retirées de rats porteurs de tumeurs cérébrales 9L 14 jours après l'inoculation de la tumeur et immédiatement congelé dans l'isopentane préalablement refroidi par de la glace sèche. Les tissus congelés ont été homogénéisés avec 1 Triton X-100 dans du PBS et centrifugés à 800 g. et le surnageant a été acceptée. La concentration en protéine de chaque échantillon de tissu a été déterminée par le kit de dosage de protéines BCA (Pierce, Rockford, IL). Des quantités égales de protéines ont été séparées sur 412 Tris-Glycine Gel (Novel Technology Experimental, San Diego, CA) avec un volume égal de Tris-Glycine SDS tampon d'échantillon 2X (NOVEX). Les protéines séparées par PAGE ont été électrotransfert sur des membranes Immobilon PVDF (Millipore, MA) en utilisant TRNSBLOT (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Après blocage avec 0,05 Tween 20 (Sigma) dans du PBS (pH 7,4) contenant 5 FCS, les membranes ont été incubées avec les anticorps primaires pendant 1 h à température ambiante. Les membranes ont ensuite été lavées et incubées avec de la peroxydase de raifort conjuguée à de mouton anti-souris IgG (Amersham Biotech Pharmacis, Inc. Piscataway, NJ). Après un lavage approfondi, les protéines immunoréactives ont été visualisées par le système ECL selon les instructions du fabricant (Amersham). Cytotoxicité in vitro de dosage. La toxicité de la Tf CRM107 pour les cellules U251MG après le traitement à la chloroquine a été étudiée en utilisant 14 l'incorporation Cleucine comme mesure de la synthèse des protéines, comme indiqué précédemment (1). En bref, après que les cellules U251MG ont été incubées avec du RPMI 1640 sans leucine pendant 6 h, la chloroquine ont été ajoutés et mis en incubation pendant 1 h. Plusieurs doses de Tf CRM107 (7 oct 15 à 7 10 8 m) ont été ensuite ajoutés 12 h plus tard, 0,1 Ci de 14 Cleucine a été ajouté, une incubation a été poursuivie pendant 1 h, puis les cellules ont été récoltées. Tous les essais de cytotoxicité ont été effectués trois fois. Les résultats sont exprimés en pourcentage de 14 Cleucine incorporation dans les cultures témoins fictives traitées et ont été exprimés en tant que moyens SE. Évaluation MTD. Après (injection intraperitoneale de 80 mg / kg de kétamine et 12 mg / kg de xylazine), l'anesthésie, les rats ont été placés dans un cadre stéréotaxique. Une incision sagittale médiane a été faite, et une perceuse dentaire a été utilisé pour placer un trou de trépan 3 mm latérales et 1 mm en avant du bregma. Toxines ont été infusés pour la détermination MTD dans un volume de 5 l intracérébrale à des rats à 1 l / min, à l'aide d'une seringue de 10 l Hamilton. DT a été donné pour obtenir des doses totales de 0.0250.2 g, et Tf-CRM107 a été donné pour obtenir des doses totales de 0.10.5 g. Les rats ont reçu par voie i. p. injections de chloroquine (45 mg / kg, n 41) ou un véhicule (sérum physiologique 0,9 n 39) 5 minutes avant l'injection intracérébrale et une fois par jour pendant 5 jours consécutifs. Nous avons observé tous les rats pendant au moins 14 jours. Si les animaux ont montré des signes de détresse (léthargie, déficit neurologique, ou l'incapacité à obtenir de la nourriture et de l'eau), ils ont été euthanasiés et décapités, et les cerveaux ont été prélevés immédiatement pour l'histologie. Nous avons considéré la dose maximale de toxine injectée par voie intracérébrale qui n'a pas causé la détresse d'être le MDT. L'IRM. L'IRM a été réalisée sur des rats sous anesthésie (injection intraperitoneale de 80 mg / kg de kétamine et 12 mg / kg de xylazine) afin de détecter des lésions cérébrales. Pour la mesure de la toxicité dans des conditions de perfusion identique à des mesures MTD, l'IRM a été réalisée 3 jours après l'injection avec 0,4 g de Tf-CRM107 (1 l / min). Le protocole utilisé sur ces images était spin-eco multislice fait sur un Tesla instrument de forage horizontal GE Omega 2 avec 4 gauss / cm gradients blindés. L'image pondérée en T1 a été prise avec un TE / TR de 20/500 ms avec un temps de balayage total de 8,5 min. Les images pondérées en T2 ont été prises avec un TE / TR de 80/1500 ms avec un temps de balayage total de 51 min. Chacune de ces tranches avaient une résolution numérique dans le plan de 390 m et l'épaisseur des tranches de 2 mm. Pour détecter un blocage complet de la toxicité du Tf CRM107 par la chloroquine dans le cerveau normal et au meilleur modèle du procédé de perfusion utilisé dans des essais cliniques (DEC), 0,05 g de Tf CRM107 dans 5 litres ont été perfusée à raison de 0,1 l / min à une pression gradient maintenue à l'aide d'une pompe à seringue (Harvard Apparatus, S. Natick, MA) et l'IRM a été réalisée 14 jours après la perfusion. Le protocole utilisé sur ces images était multislice d'écho de spin fait sur un 4,7 Tesla instrument de forage horizontal Varian Inova avec 15 gauss / cm blindé gradients. Ces images pondérées en T2 ont été prises avec un TE / TR de 80/2000 ms tranche d'épaisseur était de 1 mm avec 1,5 mm entre les centres de tranche. Chacune de ces tranches avaient une résolution de 390 m dans le plan numérique. Modèle de tumeur. U251MG solides tumeurs de gliome humain ont été cultivées en injectant 10 7 cellules U251MG cultivées s. c. dans les flancs de souris nues. Des tumeurs palpables ont été détectées au bout de 45 semaines et ont atteint 0.40.6 cm de diamètre. La taille tumorale a été évaluée en mesurant deux diamètres perpendiculaires avec un pied à coulisse à vernier et en utilisant la formule 1/2 LW 2 où L est le diamètre le plus long et W est le diamètre perpendiculaire à L. Des groupes de cinq souris nues avec des tumeurs de flanc de U251MG établis ont été randomisés pour recevoir des injections intratumorales avec 100 l de PBS ou Tf-CRM107 (100 g / ml dose totale, 10 g) avec ou sans traitement par la chloroquine. Les souris ont reçu par voie i. p. injections de chloroquine (45 mg / kg, n 5) ou un véhicule (sérum physiologique 0,9 n 5) 5 minutes avant l'injection intra-tumorale de Tf CRM107 et une fois par jour pendant 4 jours consécutifs à la même dose. Le volume tumoral, évaluée pendant 10 jours, a été représentée comme un pourcentage du volume initial et exprimé sous la forme d'une moyenne SE. Résultats et discussion Nous avons comparé les niveaux Tf-R dans différentes régions du cerveau de rat normal avec le niveau Tf-R dans les tumeurs cérébrales 9L. La Tf-R a été détecté comme un homodimère (180 kDa) sur Western blots. cerveau normal (cerveau, cervelet, la protubérance annulaire, le bulbe et le segment cervical de la moelle épinière), exprimée Tf-R avec une certaine variation d'amplitude entre les différentes régions (fig. 1 a. Lanes 15). Les pons ont exprimé des niveaux particulièrement bas Tf-R, reflétant peut-être la densité capillaire plus faible dans la substance blanche que la matière grise. 9L tumeurs cérébrales 14 jours après l'inoculation dans le cerveau de rat ont également été examinés. Le degré d'expression de la Tf-R dans les tumeurs 9L est supérieur à celui du système nerveux central normale (Fig. 1 a. Voie 6). Une analyse, Western blot de Tf-R Fisher 344 rats. Trente g d'extrait tissulaire a été exécuté sur un SDS-PAGE 412 et colorées avec un anticorps anti-Tf-R (Zymed). Les échantillons de tissu ont été de rat normal (pistes 15), et des rats portant des tumeurs cérébrales 9L 14 jours après l'inoculation de la tumeur (piste 6). 9L tumeur cérébrale exprime plus Tf-R par rapport à la CNS. B. T1 pondérée IRM (à gauche) et l'IRM pondérée en T2 (à droite) scans du cerveau de rat 3 jours après la perfusion intracérébrale avec 0,4 g de Tf-CRM107. Le grand travail représentait une hémorragie et un œdème impliqué. Le isointensity élément central de l'IRM et de faible intensité pondérée en T1 (indiqué par la flèche) sur l'IRM pondérée en T2 représenté hématies intactes avec désoxyhémoglobine après une hémorragie. La composante extérieure (de faible intensité à l'IRM T1 pondérée et de haute intensité à l'IRM pondérée en T2) représenté œdème. Lorsque 5 l de Tf-CRM107 ont été infusé dans le cerveau de rat normal à 1 l / min, des doses totales de 0,025 g ou des lésions cérébrales plus causé comme la nécrose et encephalomalacia détectée par histologie par jour 14 après la perfusion. Ces résultats sont conformes à nos précédents rapports (3). Nous avons examiné la toxicité Tf-CRM107 au cerveau de rat par IRM. IRM de cerveaux de rats 3 jours après l'injection intracérébrale avec 0,4 g de Tf-CRM107 a révélé une lésion de masse avec deux composantes de différentes intensités de signal dans le lobe frontal droit. L'élément central a été isosignal à l'IRM et de faible intensité pondérée en T1 sur la pondération T2 IRM (Fig. 1 B. Flèche). Ces modèles d'IRM sont compatibles avec les globules rouges intacts contenant désoxyhémoglobine après une hémorragie. Le composant externe était faible intensité sur l'IRM T1 pondérée et de haute intensité sur la pondération T2 IRM (Fig. 1 B), ce qui indique un œdème avec le grand secteur professionnel qui représente une hémorragie et un œdème impliqué. Examen histologique de la lésion a montré une nécrose hémorragique, la perte tissulaire, et l'invasion des macrophages (données non présentées). Ces changements dans le cerveau détectée par IRM et l'histopathologie indiquent que Tf-CRM107 provoque des lésions vasculaires. Tf-CRM107 à des doses élevées peut se lier à Tf-R sur les cellules endothéliales capillaires et provoquer une thrombose et un infarctus hémorragique, ou il peut provoquer directement une hémorragie à la suite d'une blessure endothéliale. La chloroquine est connu pour bloquer la toxicité de la DT in vitro (12). Nous avons trouvé que la chloroquine in vitro a bloqué la toxicité du Tf CRM107 10.100 fois, et à une concentration de CRM107 Tf de 10 7 11 m. les cellules ont été complètement protégées par 10 m de la chloroquine (fig. 2 A). UNE . toxicité Tf CRM107 pour U251MG cellules de gliomes humains après une exposition de 12 h avec ou sans chloroquine (1, 10, et 50 m). La chloroquine a été ajouté aux cellules 1 h avant Tf-CRM107. Tf-CRM107 sans chloroquine () est le contrôle. B. taux de survie après injection intracérébrale de toxines dans les rats. Les rats ont reçu des injections dans le lobe frontal droit avec la dose indiquée de DT et Tf-CRM107. Les symptômes neurologiques et la survie des animaux ont été surveillés. Le pourcentage de survie des animaux est représentée graphiquement (trois à sept animaux par groupe). Les rats recevant 0,4 g Tf CRM107 présentent des signes cliniques de toxicité. Nous avons postulé que l'administration systémique de la chloroquine peut protéger la vascularisation CNS de Tf-CRM107 et diminuer la toxicité du SNC in vivo. Nous avons examiné la DMT de Tf-CRM107 avec et sans administration de chloroquine. Après l'injection intracérébrale avec 0,2 g de Tf-CRM107, aucun symptôme remarquables ont été observés dans cinq des cinq rats. Cependant, cinq (71) des sept rats ayant reçu 0,3 g de Tf-CRM107 a montré des signes de détresse autour du jour 6 après l'injection. Cinq sur cinq rats qui ont reçu 0,4 g de Tf-CRM107 sont morts autour du jour 4. Toutefois, si les rats ont reçu chloroquine (45 mg / kg) après injection avec 0,3 g de Tf-CRM107, zéro cinq animaux ont montré des signes de détresse. Bien que 0,4 g de Tf-CRM107 avec la chloroquine a causé des signes de détresse dans quatre (80) de cinq animaux, la chloroquine a augmenté le taux de survie et a changé la DMT de Tf-CRM107 de 0,2 g à 0,3 g (Fig. 2 B). Ainsi, la chloroquine systémique protège les animaux contre la toxicité intracérébrale due à Tf-CRM107. perfusion intracérébrale avec 0,05 g de Tf-CRM107 a causé des dommages au cerveau histologique (ie, nécrose) dans le lobe frontal droit par jour 14. Toxicité à cette dose a été détecté comme une lésion à haute intensité sur pondération T2 IRM (Fig. 3. gauche ). l'administration de chloroquine systémique (45 mg / kg) a complètement bloqué les dommages au cerveau causés par 0,05 g de Tf-CRM107 au jour 14 (n 3 Fig. 3. droite). Pondérée T2 IRM d'un rat qui a reçu une injection intracérébrale avec 0,05 g d'Tf CRM107 (10 g / ml) avec 5 jours i. p. l'injection de la chloroquine (45 mg / kg de droite) par rapport à un rat qui a reçu du sérum physiologique à 0,9 au lieu de la chloroquine (à gauche). Tf-CRM107 a été microinfused à 0,1 l / min en utilisant une pompe à seringue. chloroquine systémique pourrait protéger la vascularisation du cerveau de intracérébrale infusé Tf-CRM107. Si la chloroquine peut diminuer la toxicité de Tf CRM107, sans diminuer l'efficacité antitumorale, un traitement amélioré pour les tumeurs du cerveau peut être possible. Le BBB peut être prévu pour limiter la quantité de chloroquine qui peut passer dans les cellules tumorales les fluides cérébrale, bain cerveau, et peut empêcher assez chloroquine de pénétrer dans le cerveau pour bloquer l'activité antitumorale de Tf-CRM107. Les cerveaux des rats et des souris sont trop petites pour modéliser avec précision les perfusions de tumeurs du cerveau par conséquent, nous avons utilisé une mesure de substitution de l'entrée de la chloroquine dans le cerveau. Pour évaluer si suffisamment chloroquine traverse la BHE pour inhiber l'activité antitumorale de Tf-CRM107, nous avons utilisé DT native qui a une sensibilité similaire à la chloroquine (1, 12). Contrairement à Tf-CRM107, qui cible les cellules endothéliales dans le SNC, DT est sélectivement toxique pour les neurones dans le cerveau de rat (13) et cible un type de cellule sur le côté du système nerveux central de la BHE que des cellules tumorales du cerveau sont ainsi. Nous avons vérifié l'effet de la chloroquine systémique sur le taux de survie des rats injectés par voie intracérébrale avec DT. Bien qu'aucun des quatre rats ayant reçu 0,1 g de DT a montré des signes de détresse, les quatre rats qui ont reçu 0,2 g de DT ont montré des signes de détresse autour du jour 5. Lorsque chloroquine a été injecté i. p. à 45 mg / kg en plus de 0,2 g de intracérébrale DT, les quatre animaux ont montré des signes de détresse autour du jour 5 (Fig. 2 B). Ainsi, i. p. injection de chloroquine ne bloque pas la toxicité de DT intracérébrale. Bien que i. p. injection de chloroquine semble atteindre et de protéger la vascularisation du cerveau de Tf-CRM107, il ne protège pas les neurones du système nerveux central de DT. tumeurs du cerveau améliorant le contraste peuvent avoir un BBB partiellement défectueux, ce qui peut laisser assez chloroquine dans la tumeur du cerveau pour bloquer Tf-CRM107 efficacité. Nous avons testé cette hypothèse, en utilisant un pire scénario de la vascularisation de la tumeur qui fuit dans la périphérie. Nous avons injecté Tf-CRM107 dans les tumeurs U251 cultivées dans les flancs de souris nude avec et sans i. p. injection de chloroquine. l'injection intratumorale de la croissance tumorale a inhibé significativement Tf CRM107, comparativement à la PBS (P 0,01) et i. p. l'injection de la chloroquine à 45 mg / kg provoque peu ou pas de blocage de l'efficacité Tf CRM107 contre le s. c. tumeur (Fig. 4). Changements dans U251MG s. c. volume de la tumeur après perfusion intratumorale de Tf-CRM107. Des groupes de cinq souris nues avec des tumeurs de flanc ont été assignés au hasard à être injecté par voie intratumorale avec 100 l de PBS ou 100 l de Tf-CRM107 (dose totale, 10 g) avec ou sans i. p. un traitement à la chloroquine. Le volume des tumeurs est représentée comme le pourcentage du volume initial, évaluée pendant 10 jours et exprimé sous forme de barres moyennes. SE. Tf-CRM107 infusé intratumorale en utilisant à haut débit microperfusion interstitielle chez des patients atteints de tumeurs cérébrales malignes récurrentes causées au moins une réduction de 50 du volume tumoral chez 8 des 15 patients (4). Pour améliorer ce résultat, nous avons considéré des façons d'augmenter la dose de Tf-CRM107 en toute sécurité plus efficace d'éradiquer les cellules tumorales. Dans ce peritumoral étude clinique, une lésion cérébrale focale est survenue chez tous les patients qui ont reçu 40 g de Tf-CRM107 à 1 g / ml. L'analyse histologique des biopsies a révélé thrombosé veinules et / ou capillaires corticaux. Ainsi, la toxicité dose-limitante associée à une perfusion intra-tumorale Tf CRM107 chez l'homme correspond à une lésion du cerveau de l'endothélium capillaire. Tf-R sont exprimés sur les cellules endothéliales dans le cerveau normal (6). Bien que la plupart Tf-R apparaissent dans la lumière du capillaire (6). ils peuvent parcourir la cellule sur le côté abluminale où ils peuvent se lier intracérébrale Tf-CRM107. Des doses élevées de Tf-CRM107 peuvent provoquer des infarctus hémorragique suivant thrombose des vaisseaux diffus ou causer une hémorragie directement après liaison à Tf-R sur les cellules endothéliales des capillaires. perfusion intracérébrale de Tf-CRM107 dans des cerveaux de rats à des doses de 0,025 g causé des dommages du système nerveux central détecté par les deux histologie et l'IRM. Nous avons détecté des dommages IRM à 40 g (environ 0,8 g / kg) de CRM107 Tf chez l'homme et à raison de 0,025 g (environ 0,1 g / kg) chez le rat. Cet écart en MDT entre les rats et les humains peut en fait être due à des différences dans la vitesse de perfusion ou infusion volume par rapport à la taille du cerveau. Parce qu'il peut être invraisemblable d'insuffler en permanence des rats pendant 5 jours à des infusions précisément modèle chez l'homme, on n'a pas été en mesure de comparer les MTD directement entre les rats et les humains par la même technique de livraison. Nous avons cherché à surmonter la toxicité limitant la dose de Tf-CRM107. Pour protéger les capillaires normaux de Tf-CRM107, nous avons identifié un médicament qui bloquerait Tf-CRM107. DT comporte une série de domaines hydrophobes (14, 15) qui insèrent dans des membranes lors d'une exposition au pH bas présent dans les endosomes et les lysosomes (8. 9. 10. 11). des blocs de Chloroquine la toxicité de la DT en augmentant et en neutralisant le pH endosomal (7, 12) et bloque la toxicité du Tf CRM107. La chloroquine peut également augmenter la survie des rats après intracérébrale perfusion Tf-CRM107 et empêche les changements d'IRM associés à la toxicité. Le signal de haute intensité sur l'IRM pondérée en T2 après la perfusion de Tf-CRM107 peut refléter les dommages histologiques en raison de capillaires thrombosées ou pétéchie. D'une manière générale, l'IRM pondérée en T2 est très sensible pour la détection de ce type de lésions cérébrales. traitement Chloroquine protégé les animaux de ces dommages causés par Tf-CRM107. Nous avons examiné la mesure dans laquelle la chloroquine traverse la BHE. Les facteurs les plus importants qui déterminent l'administration de médicaments à partir de sang dans le SNC sont la solubilité des lipides, la masse moléculaire, et la charge (16). La BBB normale inhibe le passage de médicaments solubles dans l'eau avec une masse moléculaire supérieure à 180 Da. Chloroquine (516 Da) est facilement soluble dans l'eau et insoluble dans l'alcool, le benzène, le chloroforme ou l'éther. Nos expériences ont révélé que la chloroquine n'a pas changé la DMT de intracérébrale injecté DT et n'a pas réduit les dommages au cerveau histologique chez les rats qui ont reçu DT (données non présentées). D'autre part, la chloroquine a fait bloquer la toxicité du intracérébrale injecté Tf-CRM107. Les sensibilités différentes de intracérébrale DT et Tf-CRM107 à la chloroquine systémique prend en charge le modèle qui Tf-CRM107 est spécifiquement cibler les cellules endothéliales des capillaires. Chloroquine ne traverse pas la BBB à un degré suffisant pour bloquer DT et ne devraient donc pas bloquer l'efficacité antitumorale de Tf-CRM107 injecté par voie intracérébrale. Nous directement cherché à savoir si la chloroquine inhibe l'efficacité antitumorale de Tf-CRM107. Le BBB est intact sur les bords proliférantes de tumeurs cérébrales malignes et dans les régions du cerveau infiltré, mais est plus leaky dans le centre (17). Dans la pratique, les études cliniques avec tomographie assistée par ordinateur indiquent que la perméabilité BBB est variable dans les tumeurs du cerveau (18). On a trouvé ici que le traitement à la chloroquine provoque peu ou pas de blocage de l'efficacité de intratumorale Tf CRM107 même en s. c. tumeurs totalement défaut du Bureau. Le BBB devrait encore minimiser l'accès de chloroquine aux tumeurs cérébrales. Il semble que la chloroquine peut bloquer la toxicité pour la vascularisation avec peu d'effet sur l'efficacité antitumorale de Tf-CRM107 dans le cerveau. Bien que certains effets secondaires sont connus, la chloroquine a été généralement considéré comme sûr et peut être pris par voie orale Onze volontaires en bonne santé étant donné 300 mg de chloroquine comme i. v. à dose unique perfusion se plaignait seulement des effets subjectifs secondaires, tels que des difficultés de déglutition et d'hébergement, diplopie, et la fatigue pendant i. v. perfusion aucun effet n'a été observé sur l'électrocardiogramme, la moyenne de la pression artérielle ou la fréquence du pouls (19). Les patients incapables de prendre des doses orales peuvent être donnés chloroquine par i. v. lente perfusion ou par voie s. c. ou i. m. injection (20). La tomodensitométrie et les études IRM en utilisant i. v. amélioration du contraste de définir l'emplacement des tumeurs du cerveau, car les fuites de produits de contraste des régions dépourvues d'un BBB intact. Bien que la résection de la tumeur est effectuée de façon aussi précise que possible en fonction des analyses de la lésion renforcement, le bord proliférantes de la tumeur ne contraste pas augmenté car la BHE reste intacte et les cellules tumorales sont connues pour envahir centimètres au-delà de la lésion renforcement (21. 22. 23) . Après résection chirurgicale, cette tumeur résiduelle dans les zones avec un BBB intact est le principal facteur qui sous-tend l'échec des traitements actuels de ces patients. Tf-CRM107 peut finalement être mieux utilisé peu de temps après la chirurgie pour traiter cette région du cerveau tumeur infiltrée après résection de l'ensemble du volume de rehaussement du contraste. Dans cette situation, la chloroquine devrait être fortement limitée de la tumeur par le BBB intact. Le i. v. injection de chloroquine pendant la perfusion intracérébrale de Tf-CRM107 peut protéger la vascularisation, ce qui permet moins de toxicité pour le cerveau tout en permettant des doses supérieures de Tf-CRM107 à livrer à la tumeur pour améliorer encore le taux de ce nouveau traitement du cancer de réponse. Remerciements Nous remercions Pat Johnson pour l'assistance et Daryl Despres pour son expertise dans la manipulation IRM.